Thérapie génique non virale de variants du gène du récepteur soluble de type I du TNF-α humain. Application à différents modèles de pathologies inflammatoires.

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Bloquel, Carole (2006) Thérapie génique non virale de variants du gène du récepteur soluble de type I du TNF-α humain. Application à différents modèles de pathologies inflammatoires. Doctorat biologie, ENSCP.

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• Thérapie génique non virale de variants du gène du récepteur soluble de type I du TNF-alpha humain. Application à différents modèles de pathologies inflammatoires. (deposited 03 Juillet 2006)
  • Thérapie génique non virale de variants du gène du récepteur soluble de type I du TNF-α humain. Application à différents modèles de pathologies inflammatoires. (deposited 04 Juin 2007) [Affichage actuel]

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Résumé

Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire jouant un rôle délétère dans de nombreuses pathologies. Nous nous sommes intéressés à l'inhibition du TNF-α à l'aide de variants du récepteur soluble de type I du TNF-α (hTNFR-Is) administrés par thérapie génique non virale.

Trois variants ont été étudiés : un monomère hTNFR-Is, correspondant au récepteur soluble physiologique, une protéine chimérique hTNFR-Is/mIgG1, dont l'efficacité par administration protéique est reconnue, et une forme dimérique obtenue par association de deux fragments hTNFR-Is à l'aide d'un espaceur polyglycine. La vectorisation des plasmides codant ces variants a été étudiée par différentes voies afin d'obtenir un effet systémique (électrotransfert intramusculaire, greffe de cellules autologues), ou un effet local (électrotransfert intra-articulaire (genou de souris), électrotransfert intra-oculaire). L'électrotransfert intramusculaire permettait d'obtenir une expression de protéine à long terme (supérieure à 6 mois) et dose-dépendante. La protéine chimérique était très stable dans la circulation, et était sécrétée à un taux élevé. Cette procédure n'induisait pas de réponse immune contre la protéine transgénique.

Nous avons démontré l'obtention, par électrotransfert intra-articulaire, d'une expression dosedépendante du transgène durant deux semaines. Le passage de la protéine dans la circulation était faible, ce qui était l'objectif de cette approche locale. Aux fortes doses, une réponse immune contre la protéine chimérique était observée. Nous avons montré la faisabilité de l'électrotransfert dans un muscle lisse, le muscle ciliaire de l'œil. L'expression obtenue était uniquement localisée dans le muscle ciblé, et la procédure était sûre (pas d'inflammation ni de dommages observables). L'expression du transgène était supérieure à un mois, sans passage de la protéine dans la circulation. L'électrotransfert intramusculaire de variants du hTNFR-Is était efficace (forme chimérique

principalement) dans un modèle de polyarthrite rhumatoïde (arthrite expérimentale au collagène) sur les signes cliniques et histologiques de la maladie, par un unique électrotransfert à l'apparition des signes cliniques de la maladie. La comparaison de ce traitement à l'injection répétée de protéine recombinante illustrait la potentialité d'une approche par thérapie génique, de part son efficacité à long terme.

Les approches locale et cellulaire restent à tester dans ce modèle.

L'électrotransfert intramusculaire de plasmide codant les hTNFR-Is ne permettait pas d'améliorer la récupération des fonctions motrices après un traumatisme crânien, dans un modèle murin, même si la protéine était détectée dans le cerveau, et capable d'inhiber le TNF-α. Ces résultats sont cependant très préliminaires.

L'électrotransfert intra-oculaire du plasmide codant la forme chimérique hTNFR-Is/mIgG1 permettait d'inhiber efficacement les signes cliniques et histologiques dans un modèle expérimental d'uvéite

(uvéite expérimentale aux endotoxines).

Nos résultats mettent en évidence l'efficacité de l'électrotransfert pour délivrer un gène thérapeutique

et obtenir une production locale ou systémique (selon la stratégie utilisée) de protéine thérapeutique.

Nos résultats illustrent le potentiel de nouvelles cibles (articulation, muscle lisse de l'œil) pour cette

technologie, ce qui est encourageant pour l'application future de l'électrotransfert à d'autres

tissus/organes cibles et à d'autres pathologies.

Table des Matières

ABREVIATIONS…………………………………….……… - ……..…...- 15 -

INTRODUCTION……...………………………….…………… - …….… - - 21 -

I. Le TNF-α - 23 -

II. Rôle du TNF-α dans différents types de pathologies - - 33 -

III. Thérapies protéiques et chimiques anti-TNF-α - - 51 -

IV. La thérapie génique - 59 -

OBJECTIFS………………………...… - ……………………………….…………….…….……- 73 -

MATERIEL ET METHODES……...………………………………….…………….…….……- 77 -

I. Plasmides et biologie moléculaire - - 79 -

II. Préparation des animaux - 84 -

III. Électrotransfert in vivo - 84 -

IV. Transfert de gène par cellules autologues - - 86 -

V. Prélèvements et préparation des échantillons - - 87 -

VI. Dosages et mesure d'activité biologique - - 88 -

VII. Imagerie optique du petit animal - - 91 -

VIII. Modèle d'inflammation aiguë induite par le LPS - - 92 -

IX. Modèle de traumatisme crânien - - 93 -

X. Uvéite expérimentale aux endotoxines - - 94 -

XI. Arthrite expérimentale au collagene - 95 -

XII. Localisation sur coupes histologiques des cellules transfectées par électrotransfert intra-oculaire - - 95 -

XIII. Statistiques - 96 -

RESULTATS………………………...……….…………………………………………….…………….…………- 97 -

I. Construction et validation des variants du hTNFR-Is - - 99 -

I.1. Clonage et validation in vitro - 99 -

I.2. Activité biologique des récepteurs solubles après électrotransfert intramusculaire - - 100 -

II. Validation des méthodes d'électrotransfert et caractéristiques d'expression obtenues - - 105 -

II.1. Electrotransfert intramusculaire - - 105 -

II.2. Electrotransfert intra-art - 110 -

II.3. Electrotransfert intra-ocu - 120 -

III. Potentialité thérapeutique des variants par électrotransfert - - 123 -

III.1. Traumatisme cérébral - 123 -

III.2. Uvéite expérimentale aux endotoxines - - 131 -

III.3. Arthrite expérimentale au collagène : approche systémique - - 136 -

IV. Transfert de gène par cellules autologues - - 141 -

IV.1. Validation de l'approche par thérapie génique cellulaire - - 141 -

IV.2. Caractéristiques d'expression de la lignée autologue - - 141 -

DISCUSSION………………………...……………………………………….…………………..…- 147 -

I. Stratégies de thérapie génique anti-TNF - - 149 -

II. Comparaison des variants du hTNFR-Is - - 161 -

III. Potentialité thérapeutique des variants du hTNFR-Is étudiés - - 167 -

CONCLUSION…………….………………………………………………………...…...……….- 175 -

B IBLIOGRAPHIE……………………...…………………………………………………………………- 179 -

PUBLICATIONS…………………………………………….……………………………………………………- 199 -

ANNEXE : RESUME DES RESULTATS

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