Identification et exocytose d´organelles dans les astrocytes en culture: couplage de la microscopie à onde évanescente et de la décomposition spectrale.

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Nadrigny, Fabien (2006) Identification et exocytose d´organelles dans les astrocytes en culture: couplage de la microscopie à onde évanescente et de la décomposition spectrale. Doctorat Neuroscience, ESPCI.

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Résumé

Les astrocytes sont capables de sécréter des gliotransmetteurs en réponse à une stimulation qui engendre l'augmentation de la concentration calcique intra-cellulaire. Différents mécanismes de sécrétion ont été proposés, parmi lesquels l'exocytose régulée. Mais les expériences menées dans le but d'observer la fusion d'organelles individuels dans des astrocytes en culture ont conduit à des résultats contradictoires, notamment en terme d'identité des vésicules libérables. Nos expériences préliminaires nous ont convaincus que les conflits sur l'identité des organelles libérables sont dus à de fausses colocalisations à cause du recouvrement spectral des marqueurs fluorescents utilisés et de la présence d'autofluorescence dans les astrocytes en culture.
Nous avons donc adapté la décomposition spectrale à l'identification rigoureuse d'organelles individuels et au suivi de leur exocytose. La décomposition spectrale permet la séparation de sources de fluorescence mal séparées et ainsi l'étude de l'expression et de la colocalisation de protéines fluorescentes, même en présence d'autofluorescence. Nous avons à cette occasion introduit un intervalle de confiance du résultat de l'estimation des quantités de colorants. Appliquée au marquage des organelles astrocytaires avec la EGFP et l'acridine orange, cette méthode a montré que l'apparente colocalisation entre ces marqueurs reflète en fait la présence d'acridine orange plus intense que la EGFP et coexistant dans les mêmes organelles sous deux formes verte et rouge. A l'aide de la décomposition spectrale et de la microscopie à onde évanescente, nous avons ensuite montré que les organelles autofluorescents dans les astrocytes sont en majorité des lysosomes capables de fusionner lors d'une stimu\-lation qui engendre l'augmentation du calcium intra-cellulaire. Ces lysosomes sont peut-être les organelles majoritairement responsables de l'exocytose dans les astrocytes en culture.

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