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Jan, Gaëlle (2007) Le rôle d’une sérine-thréonine phosphatase de type 2C parasitaire (TgPP2C) dans l’interaction Toxoplasma gondii – cellule hôte : Identification des modules interactifs au sein du tricomplexe actine-toxofiline-TgPP2C et étude de ses propriétés fonctionnelles dans le parasite et la cellule infectée. Doctorat Biologie, AgroParistech 2007AGPT0015 p.189.
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( 11182 Kb )Résumé
Toxoplasma gondii, le protozoaire intracellulaire obligatoire responsable de la toxoplasmose, fait partie du phylum des Apicomplexa. Comme les autres membres de ce phylum, il a développé des propriétés mobiles particulières qui lui permettent de se déplacer et d’envahir très rapidement la cellule dans laquelle il se multiplie. Ces processus de locomotion et d’invasion sont dépendants du cytosquelette d’actine du parasite. Une protéine, la toxofiline, identifiée uniquement chez T. gondii, a été caractérisée au laboratoire comme étant capable de réguler la dynamique du cytosquelette d’actine. Plus précisément, la toxofiline séquestre l’actine monomérique, empêchant ainsi sa polymérisation. L’affinité de la toxofiline pour l’actine est modulée par phosphorylation/déphosphorylation par une caséine kinase 2 et une sérine-thréonine phosphatase de type 2C (TgPP2C). Mon projet de thèse a porté sur l’étude du rôle de la TgPP2C dans l’interaction entre T. gondii et sa cellule hôte.
Le premier objectif de mon travail a été de disséquer les interactions moléculaires entre les trois membres du complexe actine G – toxofiline – TgPP2C. J’ai ainsi identifié, par différentes approches biochimiques, les régions et les acides aminés de la toxofiline, critiques pour sa liaison avec ses deux partenaires. Tout d’abord, la toxofiline possède un domaine suffisant pour lier et séquestrer l’actine G dans des tests de polymérisation. Ce domaine, qui a été appelé CC1A, correspond à une région de 9 kDa comprenant un domaine en super hélice. Trois séries de peptides chevauchants, présents dans CC1A, capables de lier l’actine G, ont été plus précisément détectés. Nous avons également identifié d’autres régions de la toxofiline ayant des propriétés de liaison différentes à l’actine, en particulier dans le domaine N-terminal (NoCC). Le premier domaine en super hélice, et en position C-terminale de CC1A, lie la TgPP2C. Une autre séquence de plusieurs acides aminés, dans la région N-terminale et contenant la sérine 53, substrat de la TgPP2C, interagit avec la phosphatase.
Le deuxième objectif de mon projet de thèse a porté sur l’analyse des propriétés fonctionnelles de la TgPP2C dans le tachyzoïte. Par une stratégie de surexpression dans les parasites, nous avons tout d’abord montré que la TgPP2C jouait un rôle dans la multiplication du parasite. En effet, des tachyzoïtes qui surexpriment la forme active de la TgPP2C ne se divisent pas normalement dans la vacuole parasitophore et finissent par dégénérer. On observe des parasites anormaux avec un noyau géant, qui suggère un défaut dans la division nucléaire ou l’individualisation des cellules filles. Nous avons également mis en évidence que la TgPP2C est sécrétée par le parasite dans le cytoplasme et le noyau de sa cellule hôte. Cette sécrétion est dépendante du domaine N-terminal unique de 18 acides aminés de cette phosphatase.
Enfin, le troisième objectif de mon travail a consisté à étudier le rôle de la TgPP2C dans la cellule infectée. Par une approche d’expression ectopique de la phosphatase dans des cellules de mammifère, nous avons mis en évidence que la TgPP2C agissait au niveau du cycle de ces cellules. En effet, les cellules qui expriment la phosphatase parasitaire sont bloquées en phase G2/M. Certaines cellules en division n’achèvent pas la cytocinèse et restent reliées par un long pont cytoplasmique contenant de l’ADN et la TgPP2C. A un temps plus tardif, elles présentent les signes caractéristiques d’une apoptose. D’autre part, nous avons réalisé un crible double hybride en levure afin d’identifier les partenaires hôtes de la TgPP2C. Plusieurs protéines candidates on ainsi été obtenues, dont la protéine Spire qui possède des propriétés de nucléation de l’actine in vitro et dont nous avons confirmé l’interaction avec la TgPP2C. La poursuite de cette étude permettra de caractériser l’effet de la TgPP2C sur Spire, et le rôle de cette dernière dans le développement des tachyzoïtes.
| Type d'EPrint: | Thèse (Doctorat) |
|---|---|
| Directeur de Mémoire: | Tardieux, Isabelle |
| Date: | Juin 2007 |
| Jury de Mémoire: | Meunier, Jean-Claude et Guillen-Aghion, Nancy et Villena, Isabelle et Cayla, Xavier et Dupouy-Camet, Jean |
| Ecole Doctorale: | ED 435 AGRICULTURE, ALIMENTATION, BIOLOGIE, ENVIRONNEMENTS ET SANTE |
| Discipline: | Biologie |
| Fonds: | AgroParistech |
| Institution: | AgroParistech |
| Sujets: | 7. Sciences de la vie et ingénierie du vivant |
| Mots-clés libres: | Toxoplasma gondii, sérine-thréonine phosphatase de type 2C, Interaction protéine-protéine, Toxofiline, Actine, Cycle cellulaire, Sécrétion |
| Code ID: | 2663 |
| Déposé par : | JAN JAN |
| Déposé le : | 15 Octobre 2007 |
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Table des Matières
TABLE DES MATIERES 3
TABLE DES FIGURES 6
ABREVIATIONS 8
INTRODUCTION GENERALE 12
I- LA TOXOPLASMOSE, UNE INFECTION COMMUNE GENERALEMENT SANS CONSEQUENCE 12
A. Epidémiologie humaine 12
B. Pathologie humaine 13
C. La toxoplasmose chez les animaux 14
II- LE PARASITE RESPONSABLE : TOXOPLASMA GONDII, MEMBRE DU PHYLUM DES APICOMPLEXA 16
A. Le cycle biologique de T. gondii 16
B. Ultrastructure du tachyzoïte de T. gondii 19
C. Les différentes lignées de T. gondii 19
III- UN ZOÏTE MOBILE QUI ENVAHIT SA CELLULE HOTE PAR UN PROCESSUS ACTIF 22
A. La mobilité et l’invasion, des processus dépendants du moteur actomyosine du parasite 22
B. Un préalable à l’invasion : l’attachement réversible à la cellule hôte 23
C. La première étape de l’invasion : l’importance des protéines micronémales dans l’attachement apical 24
D. Le rôle d’AMA1 et des protéines du cou des rhoptries dans la formation de la jonction mobile lors de la pénétration 27
E. Le rôle des protéines de rhoptries dans la formation de la vacuole parasitophore. 28
F. Le rôle des protéines des granules denses dans le fonctionnement de la vacuole parasitophore 30
IV- OBJECTIFS 31
CHAPITRE I 33
IDENTIFICATION DES SITES D’INTERACTION ENTRE LES TROIS MEMBRES DU COMPLEXE ACTINE-TOXOFILINE-TGPP2C 33
I- INTRODUCTION 33
A. Le rôle du cytosquelette d’actine dans la locomotion 35
1- Les propriétés dynamiques de l’actine 35
2- La régulation du cytosquelette d’actine par les protéines associées 37
a) Les protéines nucléatrices 40
b) Les protéines séquestrantes 42
c) Les protéines coiffantes 42
d) Les protéines coupantes 43
e) Les protéines responsables de l’arrangement des filaments dans l’espace 43
3- Rôle des myosines dans la locomotion 45
B. La locomotion de T. gondii : le glissement rotatif 45
1- Les particularités de l’actine de T. gondii 47
2- Les particularités de la myosine de T. gondii 49
3- Contrôle de la dynamique de l’actine parasitaire par les protéines liant l’actine 50
C. Une protéine liant l’actine, spécifique de T. gondii : la toxofiline 52
1- Identification et propriétés fonctionnelles de la toxofiline 52
2- Régulation de l’activité de la toxofiline : rôle de la CKII et de la TgPP2C 55
3- La localisation de la toxofiline : une protéine sécrétée ? 57
D. Objectifs et démarche expérimentale 57
II- MATERIEL ET METHODES 59
A. Préparation des protéines recombinantes 59
1- Clonage des différents fragments de la toxofiline 59
2- Purification des protéines recombinantes 60
B. Gels natifs 60
C. Tests de liaison à l’actine 61
1- Tests de liaison à l’actine G 61
2- Tests de compétition pour la liaison à l’actine G 61
D. Cinétique de polymérisation de filaments d’actine pyrène 62
E. Tests de liaison à la TgPP2C 63
1- Tests de liaison à la TgPP2C 63
2- Tests de liaison du complexe actine-CC1-TgPP2C 63
F. Peptide-spot mapping 63
III- RESULTATS 66
A. Identification des sites de liaison entre la toxofiline et l’actine 66
1- La toxofiline se lie à et séquestre l’actine G via son domaine CC1A 66
2- Trois séquences peptidiques linéaires au sein de CC1A se lient à l’actine G 68
3- NoCC se lie à l’actine G sans induire de séquestration ou de nucléation 73
B. Identification des sites de liaison entre la toxofiline et la TgPP2C 75
1- Le complexe CC1-actine G se lie à la TgPP2C via CC1B mais pas CC1A 75
2- La toxofiline présente deux sites de liaison potentiels à la TgPP2C, respectivement au sein de CC1B et de NoCC 77
IV- DISCUSSION 78
CHAPITRE II 84
ANALYSE DES PROPRIETES FONCTIONNELLES DE LA TGPP2C DE TOXOPLASMA GONDII PAR SUREXPRESSION DANS LES TACHYZOÏTES 84
I- INTRODUCTION 84
A. Les sérine-thréonine phosphatases de type 2C 86
1- Caractéristiques des sérine-thréonine phosphatases 86
2- Les phosphatases de type 2C 88
3- Propriétés fonctionnelles connues des PP2C 89
a) Les PP2C, le cycle cellulaire et l’apoptose. 89
b) Les PP2C et l’activation des voies de réponse au stress 90
c) Les PP2C et la régulation de la dynamique de l’actine 91
B. Les phosphatases de T. gondii 91
1- Les phosphatases connues chez les Apicomplexes 91
2- La TgPP2C : caractéristiques et fonctions connues 94
C. La réplication du tachyzoïte de T. gondii : l’endodyogénie 96
1- Les différentes étapes de l’endodyogénie 96
2- Les différentes étapes du cycle cellulaire : moyens d’étude, comparaison et implications pour T. gondii 98
3- Division cellulaire et évolution du contenu nucléaire 98
D. Objectifs et démarche expérimentale 99
II- MATERIEL ET METHODES 100
A. Parasites et culture cellulaire 100
1- Culture cellulaire 100
2- Culture des parasites 100
B. Constructions plasmidiques codant pour différentes formes de la TgPP2C 100
1- Constructions permettant la surexpression de la TgPP2C dans le tachyzoïte 102
2- Construction des formes mutées « inactives » de pMAH14-TgPP2C 102
3- Construction de pMAH14-TgPP2CΔNter et de chimères portant le domaine Nter 102
C. Transfection des parasites 105
D. Marquage des tachyzoïtes par immunofluorescence 105
III- RESULTATS 108
A. La surexpression de la TgPP2C dans les tachyzoïtes bloque leur division 108
1- La surexpression de la TgPP2C active provoque un défaut de développement des parasites 108
2- Les parasites surexprimant la TgPP2C possèdent un noyau aberrant 110
3- La TgPP2C endogène est localisée à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme du parasite 110
B. La TgPP2C surexprimée est sécrétée dans la cellule hôte via son domaine N-terminal 112
1- La TgPP2C est sécrétée dans la cellule hôte 112
2- La TgPP2C n’est pas sécrétée si le domaine N-terminal est tronqué 116
3- Le domaine N-terminal suffit à faire sécréter une protéine exogène 116
IV- DISCUSSION 119
A. La TgPP2C semble impliquée dans la multiplication du parasite 119
B. La TgPP2C est sécrétée dans la cellule hôte 121
CHAPITRE III 124
ETUDE DU ROLE DE LA TGPP2C DANS LA CELLULE INFECTEE 124
RECHERCHE DE SUBSTRATS/PARTENAIRES HOTES 124
I- INTRODUCTION 124
A. T. gondii agit directement sur certaines voies de signalisation de sa cellule hôte 124
B. Des sérine-thréonine kinases et phosphatases parasitaires sécrétées agissent sur la cellule hôte 125
C. Objectifs et démarche expérimentale 126
II- MATERIEL ET METHODES 127
A. Expression hétérologue de la TgPP2C 127
1- Clonage des vecteurs d’expression de la TgPP2C sauvage et mutée dans les cellules de mammifère 127
2- Transfe