Production d’aromes soufres par les flores d’affinage : catabolisme de la l-cysteine.

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Lopez del castillo - lozano, Micloth (2007) Production d’aromes soufres par les flores d’affinage : catabolisme de la l-cysteine. Doctorat Science des aliments, AgroParistech 2007AGPT0010 p.213.

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Résumé

Les composés soufrés volatils (CSV) sont des composés majeurs de l’arôme des

fromages. Même présents à de très faibles concentrations, ils contribuent de manière

significative à leur qualité aromatique et à leur typicité, du fait notamment de leur faible seuil

de détection et de leur forte réactivité. Jusqu'à présent, les études portant sur la production de

CSV étaient axées essentiellement sur le catabolisme de la méthionine, sans inclure

l’implication potentielle de la cystéine dans leur production.

Cette étude a donc eu pour principal objectif d’étudier dans quelle mesure la cystéine

pourrait contribuer à la production de CSV par les levures et les bactéries de la flore

d'affinage.

La mise au point d'une technique de piégeage dans un système fermé, et de capture in

situ de l'H2S produit par le catabolisme de la cystéine, nous a permis d’effectuer une sélection

de souches les plus aptes à dégrader la cystéine. Cette technique a donc été utilisée pour

quantifier la production d'H2S de vingt souches de levures et dix-sept souches de bactéries.

Cinq souches de levures et quatre souches de bactéries ont été ainsi sélectionnées, et nous

avons donc étudié leur capacité à produire des CSV à partir i) de la cystéine, ii) de la

méthionine ou iii) de mélanges méthionine-cystéine.

En ajoutant de la cystéine, aucun nouveau CSV n'a été produit par les levures, et

seulement des traces de CSV ont été quantifiées chez les bactéries. Avec l'ajout de méthionine,

deux voies de dégradation de la methionine ont été mises en évidence chez les souches de

levures : une produisant du méthional/méthionol, l’autre du DMDS/DMTS. Deux nouveaux

composés soufrés volatils ont également été détectés : la 2-méthyl-tétrahydrothiophène-3-one

et le 1,3-oxothiane. Concernant les bactéries, elles produisent sur cystéine seule ou

méthionine seule les CSV majeurs du catabolisme de la méthionine (DMDS, DMTS, DMQS

et des thioesters).

En ce qui concerne les mélanges de méthionine-cystéine, la production de CSV est

plus ou moins réduite selon la concentration de cystéine ajoutée. Cet effet correspond

certainement à une dégradation réduite de la méthionine consécutive à l'ajout de cystéine.

Bien que cet effet demeure souche dépendant, des modifications du profil des CSV produits

ont été observées dans tous les cas. Chez les bactéries, nous avons obtenu une production

accrue des polysulfures DMTS et DMQS, parallèlement à la diminution de la production de

thioesters. Chez les levures, on observe une diminution de la concentration de

méthional/méthionol et de thioesters, mais sans augmentation de la production des

polysulfures. Une faible concentration des formes solubles et réactives de l'H2S (HS- et S2-)

dans le milieu de culture acide utilisé pour les levures pourrait expliquer ce résultat.

Des essais de flairage ont montré que l'addition de faibles concentrations de cystéine,

en présence de méthionine, assure la production de notes aromatiques globalement équilibrées

et proches de celles d’un fromage à pâte molle croûte lavée bien affiné.

Ainsi, dans un contexte fromager, nous pouvons raisonnablement supposer que l'H2S

produit par le catabolisme de la cystéine ne participerait pas à la modification du profil de

CSV en début d'affinage, à cause du caractère acide du caillé pendant cette période. Toutefois,

l’augmentation du pH, résultat du développement des levures déacidifiantes, peut augmenter

la réactivité de l'H2S qui, avec la production simultanée de méthanethiol par le catabolisme de

la méthionine des bactéries d’affinage, pourrait ainsi favoriser un meilleur équilibre entre les

polysulfures et les thioesters. Ainsi, la co-production de ces molécules soufrées par les levures

et les bactéries d’affinage pourrait favoriser le développement d’un arôme équilibré de type

fromage affiné.

Table des Matières

SOMMAIRE DES FIGURES - V

SOMMAIRE DES TABLEAUX - VII

LISTE DES ANNEXES - IX

LISTE DES PRINCIPALES ABREVIATIONS - X

INTRODUCTION 1

A. ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I. LE PROCESSUS D'AFFINAGE DU FROMAGE - 7

I.1. PROTEOLYSE ET GENERATION DES COMPOSES D'AROMES - 7

I.1.1. Les caséines : principales protéines dans le caillé - 8

I.1.2. Complexes enzymatiques impliqués dans la dégradation des protéines - 11

I.1.2.1. Activité protéolytique du levain lactique - 12

I.1.2.2. Activité protéolytique des flores d'affinage - 12

I.1.2.2.1. Des bactéries propioniques - 13

I.1.2.2.2. Des bactéries de surface - 13

I.1.2.2.3. Des levures et moisissures - 14

I.1.3. Principales enzymes impliquées dans le catabolisme des acides aminés libres - 15

I.1.3.1. Les transaminases - 16

I.1.3.2. Les décarboxylases - 19

I.1.3.3. Les déshydrogénases - 20

I.1.3.4. Les lyases - 22

II. BIOSYNTHESE DES ACIDES AMINES SOUFRES : L-CYSTEINE ET LMETHIONINE - 23

II.1. ASSIMILATION DU SOUFRE - 24

II.2. BIOSYNTHESE DE LA L-CYSTEINE - 27

II.3. BIOSYNTHESE DE LA L-METHIONINE - 29

II.4. CONSERVATION DU SOUFRE REDUIT DANS LE GLUTATHION - 30

II.5. TRANSPORT DU SULFATE, DE LA L-CYSTEINE ET DE LA L-METHIONINE - 31

III. GENESE DES COMPOSES SOUFRES VOLATILS - 33

III.1. CATABOLISME DE LA L-METHIONINE - 33

III.2. CATABOLISME DE LA L-CYSTEINE - 40

III.3. LES COMPOSES SOUFRES VOLATILS DANS LE FROMAGE - 47

III.3.1. Le méthanethiol et le méthional - 47

III.3.2. Les polysulfures - 49

III.3.3. Les thioesters - 52

III.3.4. Le sulfure d’hydrogène ou H2S - 54

III.4. METHODES DE QUANTIFICATION DE L'H2S - 55

IV. LA FLORE D'AFFINAGE DES FROMAGES A PATE MOLLE - 58

IV.1. LES LEVURES - 58

IV.1.1. Le genre Debaryomyces - 58

IV.1.2. Le genre Geotrichum - 59

IV.1.3. Le genre Kluyveromyces - 60

II

IV.1.4. Le genre Saccharomyces - 60

IV.1.5. Le genre Yarrowia - 61

IV.2. LES BACTERIES - 62

IV.2.1. Le genre Arthrobacter - 63

IV.2.2. Le genre Brevibacterium - 63

IV.2.3. Le genre Corynebacterium - 64

IV.2.4. Le genre Microbacterium - 65

IV.2.5. Le genre Staphylococcus - 65

B. MATERIELS ET METHODES

V. MATERIEL MICROBIOLOGIQUE - 69

V.1. COLLECTION DE SOUCHES UTILISEES - 69

V.1.1. Conservation des souches - 69

V.1.2. Pureté des cultures - 69

VI. CONDITION DE CULTURE DES MICRO-ORGANISMES - 71

VI.1. PRE-CULTURES EN MILIEU COMPLEXE - 71

VI.2. ETUDE I. CRIBLAGE DES SOUCHES POUR LA PRODUCTION DE SULFURE D’HYDROGENE

(H2S) ……………………………………………………………………………………………..71

VI.2.1. Préparation des flacons piège pour l'H2S - 72

VI.3. ETUDE II : EFFET DE LA CYSTEINE SUR LA PRODUCTION DE CSV - 73

VII. ANALYSES REALISEES SUR LES CULTURES - 74

VII.1. ANALYSES PHYSICO-CHIMIQUES - 74

VII.1.1. Mesure du pH - 74

VII.1.2. Mesure de l’absorbance - 74

VII.1.3. Mesure du poids sec - 74

VII.2. ANALYSES CHIMIQUES - 74

VII.2.1. Dosage de la L-cystéine - 74

VII.2.1.1. Méthode par dérivation au DTNB - 74

VII.2.1.2. Réaction à la ninhydrine acide - 76

VII.2.2. Dosage de l’H2S par synthèse du bleu de méthylène - 77

VII.3. DOSAGES DES COMPOSES NON VOLATILS PAR CLHP - 78

VII.3.1. Dosage de la L-méthionine résiduelle - 78

VII.3.2. Dosage des cétoacides et des hydroxyacides - 79

VII.4. DOSAGES DES COMPOSES PAR CPG-SM - 79

VII.4.1. Les composés volatils - 79

VII.4.1.1. Extraction par analyse dynamique de l’espace de tête (purge and trap) - 79

VII.4.1.2. Extraction par SPME - 81

VII.4.2. Séparation, détection et quantification des composés volatils - 81

VII.4.3. Les composés non-volatils : Dérivation et analyse par GC-MS - 82

VII.4.3.1. Protocole de double dérivation - 82

VII.4.3.2. Analyse par CPG-SM - 84

VII.5. DOSAGES ENZYMATIQUES - 85

VII.5.1. Préparation des extraits acellulaires - 85

VII.5.2. Dosage des protéines - 85

VII.5.3. Dosage de l’activité déméthiolase - 86

VII.5.4. Dosage de l’activité cystathionine β−γ-lyase - 87

VII.5.5. Dosage de l’activité transaminase - 89

VII.6. ANALYSE STATISTIQUE - 92

III

C. RESULTATS ET DISCUSSION

VIII. MISE AU POINT DES TECHNIQUES - 95

VIII.1. MISE AU POINT DU TEST DE CRIBLAGE : DOSAGE DE L'H2S - 95

VIII.1.1. Test de dosage de l’H2S par précipitation avec des métaux - 95

VIII.1.2. Méthode de dosage de l'H2S par la réaction de synthèse du bleu de méthylène - 97

VIII.2. MISE AU POINT DU DOSAGE DE LA CYSTEINE - 101

VIII.2.1. Dosage par dérivation au DTNB et séparation par CLHP - 101

VIII.2.2. Dosage par réaction à la ninhydrine acide - 103

VIII.2.3. Perte de la cystéine par oxydation en milieu complexe - 104

IX. CRIBLAGE DES SOUCHES ET PRODUCTION DE COMPOSES SOUFRES

VOLATILS DANS DES MILIEUX SYNTHETIQUES ENRICHI EN L-CYSTEINE - 109

X. EFFET DE LA CYSTEINE SUR LA PRODUCTION DE CSV DANS DES MILIEUX

ENRICHIS EN METHIONINE ET EN CYSTEINE - 119

X.1. ETUDE CHEZ LES BACTERIES SELECTIONEES - 120

X.1.1. Etude de B. aurantiacum ATCC 9175 et C. glutamicum COD13 - 121

X.1.1.1. Croissance des bactéries - 121

X.1.1.2. Effet de l'addition de cystéine sur la production totale de CSV - 121

X.1.1.3. Effet de l'addition de cystéine sur la composition du profil de CSV - 123

X.1.1.4. Consommation de la méthionine et de la cystéine - 123

X.1.1.5. Recherche des intermédiaires métaboliques de dégradation de la méthionine et la cystéine.. 124

X.1.1.6. Effet de l'addition de cystéine sur des activités enzymatiques impliquées dans le catabolisme

des acides aminés soufrés - 125

X.1.1.7. Discussion et Conclusions - 127

X.1.2. Etude d’Arthrobacter spp 7(2) et de B. linens BL918 - 129

X.1.2.1. Effet de l'addition de cystéine sur la production totale de CSV - 133

X.1.2.2. Effet de l'addition de cystéine sur la composition du profil de CSV - 135

X.1.2.3. Consommation de la méthionine et de la cystéine - 135

X.1.2.4. Recherche des intermédiaires métaboliques de dégradation de la méthionine et la cystéine.. 137

X.1.2.5. Effet de l'addition de cystéine sur des activités enzymatiques impliquées dans le catabolisme

des acides aminés soufrés - 138

X.1.2.6. Effet de la cystéine sur l'évaluation sensorielle des cultures - 140

X.1.2.7. Discussion et Conclusions - 141

X.2. ETUDE CHEZ LES LEVURES SELECTIONNEES - 143

X.2.1. Résultats - 147

X.2.1.1. Croissance des levures - 147

X.2.1.2. Production de CSV à partir de la méthionine - 147

X.2.1.3. Production d’H2S et de CSV à partir des mélanges de méthionine-cystéine - 148

X.2.1.4. Consommation de la méthionine et de la cystéine - 150

X.2.1.5. Recherche des intermédiaires métaboliques de dégradation de la méthionine et la cystéine.. 152

X.2.1.6. Effet de l'addition de cystéine sur des activités enzymatiques impliquées dans le catabolisme

des acides aminés soufrés - 154

X.2.1.7. Effet de la cystéine sur l'évaluation sensorielle des cultures - 155

X.2.2. Discussion et Conclusions - 157

D. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES…………….……..……169

E. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES…………..………….. 177

F. ANNEXES………………………………………………………… - 205

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