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Couesnon, Aurélie (2007) Passage de la neurotoxine botulique à travers la barrière intestinale. Doctorat Biologie, Institut Pasteur, Unité des Bactéries Anaérobies et Toxines, F-75015, AgroParistech 2007AGPT0065.
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Résumé
flasque, est produite par des bactéries anaérobies du genre Clostridium. Les BoNTs,
classifiées en 7 types (A à G), forment divers complexes avec des protéines non toxiques,
dont le composant non toxique non hémagglutinant (NTNH) et les hémagglutinines (HAs).
Les gènes sont organisés, au sein du locus botulique, selon deux opérons divergents, ntnhbont/
A et ha34-ha17-ha70 pour le type A, dont l’expression est positivement régulée par le
facteur sigma alternatif BotR. Un pic d’expression synchrone de tous les gènes du locus de
type A est mesuré par RT-PCR en temps réel lors de la transition entre les phases
exponentielle et stationnaire de croissance, en parallèle avec l’augmentation du titre en toxine
du surnageant de culture. Dans un modèle d’épithélium intestinal, BoNT/A purifiée est
transcytosée après liaison via le domaine Hc/A à des récepteurs apicaux comprenant des
gangliosides et des protéines potentiellement apparentées à SV2. L’intensité de liaison et
l’efficacité de transport de la toxine sont supérieures dans les cellules intestinales de type
crypte plutôt qu’entérocyte. Injectés dans la lumière d’une anse iléale ligaturée, BoNT/A
inhibe les contractions des muscles lisses et le domaine Hc/A fluorescent progresse de la
muqueuse, via certaines cellules des cryptes, vers la sous-muqueuse et la musculeuse où il
cible certaines terminaisons nerveuses, majoritairement cholinergiques. Hc/A entre par des
voies distinctes dans les cellules neuronales (voie clathrine dépendante de la dynamine) et les
cellules intestinales (voie non-clathrine, dépendante de Cdc42 et de la dynamine).
| Type d'EPrint: | Thèse (Doctorat) |
|---|---|
| Directeur de Thèse: | Popoff, Michel Robert et Meunier, Jean-Claude |
| Date: | 21 Novembre 2007 |
| Jury de Thèse: | Poulain, Bernard et Gillet, Daniel et Molgo, Jordi et Dane, Claire |
| Ecole Doctorale: | ED 435 AGRICULTURE, ALIMENTATION, BIOLOGIE, ENVIRONNEMENTS ET SANTE |
| Discipline: | Biologie |
| Fonds: | AgroParistech |
| Institution: | AgroParistech |
| Laboratoire: | Institut Pasteur, Unité des Bactéries Anaérobies et Toxines, F-75015 |
| Sujets: | 7. Sciences de la vie et ingénierie du vivant |
| Mots-clés libres: | Clostridium botulinum, Toxine, Régulation transcriptionnelle, Intestin, Récepteurs membranaires, Trafic intracellulaire., Clostridium botulinum, Toxin, Transcriptional regulation, Intestine, Membrane receptors, Intracellular trafficking. |
| Code ID: | 3461 |
| Déposé par : | Nadine Pontal |
| Déposé le : | 27 Février 2008 |
Table des Matières
1 L’agent du botulisme et ses armes létales, les neurotoxines
botuliques - 9
1.1 Historique - 9
1.2 Formes de botulisme - 11
1.2.1 Intoxination botulique - 11
1.2.2 Toxi-infection botulique - 11
1.2.3 Botulisme par blessure - 11
1.3 Manifestations cliniques et traitement du botulisme - 13
1.4 Agent du botulisme : organisme et habitat - 15
1.4.1 Caractéristiques physiologiques des Clostridium neurotoxinogènes - 15
1.4.2 Classification des Clostridium neurotoxinogènes - 15
1.4.3 Habitat des Clostridium neurotoxinogènes - 17
1.5 Neurotoxines et complexes botuliques : organisation des protéines
et des gènes associés - 19
1.5.1 Formation des complexes botuliques - 19
1.5.1.1 Découverte des complexes - 19
1.5.1.2 Structure des complexes - 21
1.5.1.3 Caractéristiques des BoNTs et des ANTPs - 23
1.5.2 Structure des BoNTs - 25
1.5.3 Diversité génétique des souches de Clostridium neurotoxinogènes - 27
1.5.3.1 Caractéristiques des gènes du locus botulique - 27
1.5.3.2 Localisation génomique et transfert de gènes du locus botulique - 31
1.5.4 Organisation génétique du locus botulique - 35
1.6 Régulation des gènes du locus botulique - 39
2 Interaction de la neurotoxine botulique avec l’intestin - 43
2.1 Description anatomique et fonctionnelle du tractus gastrointestinal
des mammifères - 43
2.2 Structure de la paroi intestinale - 43
2.2.1 La muqueuse intestinale - 45
2.2.1.1 Les villosités intestinales - 45
2.2.1.2 Les cryptes intestinales - 47
2.2.2 La sous-muqueuse - 49
2.2.3 La musculeuse - 51
2.2.4 La séreuse - 51
2.3 Système nerveux entérique - 53
2.3.1 Système nerveux entérique extrinsèque - 53
2.3.2 Système nerveux entérique intrinsèque - 55
2.3.3 Automatisme et contrôle nerveux de la motricité digestive - 59
2.3.4 Le système glial entérique - 63
2.4 Etudes in vivo de l’interaction de BoNT/A avec l’intestin - 64
2.4.1 Mise en évidence d’une corrélation entre stabilité et toxicité des complexes
botuliques - 64
2.4.2 Passage de la neurotoxine à travers la barrière intestinale : voies
transcellulaire et paracellulaire - 66
2
3 Liaison, entrée et trafic des neurotoxines botuliques dans les
cellules neuronales et intestinales - 69
3.1 Liaison des neurotoxines botuliques aux récepteurs cellulaires - 71
3.1.1 Les gangliosides - 71
3.1.1.1 Liaison des BoNTs aux gangliosides - 73
3.1.1.2 Liaison des hémagglutinines aux gangliosides - 75
3.1.2 Les protéines impliquées dans la liaison des BoNTs aux cellules - 77
3.1.2.1 Les synaptotagmines I et II - 77
3.1.2.2 La protéine des vésicules synaptiques SV2 - 79
3.2 Voies d’entrée des BoNTs dans les cellules - 85
3.2.1 Organisation de la membrane plasmique en microdomaines - 85
3.2.2 Principales voies d’entrée dans les cellules - 87
3.2.2.1 Organisation des cellules épithéliales et du trafic endocytotique - 89
3.2.2.2 Caractéristiques des voies d’endocytose - 91
3.2.3 Internalisation et translocation des neurotoxines dans les cellules
neuronales - 95
3.2.3.1 Cycle des vésicules synaptiques - 95
3.2.3.2 Internalisation de le neurotoxine tétanique - 95
3.2.3.3 Internalisation de la neurotoxine botulique - 97
3.2.3.4 Translocation des BoNTS dans le cytosol neuronal - 97
3.2.4 Transport des BoNTs à travers les cellules intestinales - 99
3.2.4.1 Mécanisme de la transcytose - 99
3.2.4.2 Exemples de transcytose à travers des modèles de barrière intestinale - 99
3.2.4.3 Mise en évidence du transport des complexes botuliques sur un modèle
d’épithélium intestinal - 103
3.3 Activité enzymatique des BoNTs au niveau des terminaisons
nerveuses - 109
4 Résultats - 115
4.1 Article n°1 : Expression des gènes des neurotoxines botuliques A et
E et des gènes des protéines non toxiques associées pendant la transition
de phase et stabilité à haute température : Analyse par PCR en temps réel
en transcription inverse - 115
4.1.1 Résumé - 115
4.1.2 Souches de C. botulinum utilisées - 115
4.1.3 Quantification de l’expression des gènes du locus botulique et de la
production de toxine - 116
4.1.4 Stabilité des BoNTs et des ANTPs à température élevée - 117
4.2 Article n°2 : Transcytose médiée par récepteur de la neurotoxine
botulique A à travers des monocouches de cellules intestinales - 119
4.2.1 Résumé - 119
4.2.2 Choix du modèle de barrière intestinale et des lignées cellulaires - 119
4.2.3 Transcytose de BoNT/A à travers les Caco-2 et les m-ICcl2 - 120
4.2.3.1 Caractéristiques du passage - 120
4.2.3.2 Spécificité de BoNT/A - 120
4.2.4 Caractérisation des récepteurs de BoNT/A sur les cellules intestinales ..121
4.2.4.1 Spécificité de la liaison - 121
3
4.2.4.2 Rôle des gangliosides - 121
4.2.4.3 Rôle d’une protéine apparentée à SV2 - 121
4.3 Article n°3 : La neurotoxine botulique A passe à travers la
muqueuse intestinale de souris et cible localement certaines terminaisons
nerveuses - 123
4.3.1 Résumé - 123
4.3.2 BoNT/A, injectée dans la lumière d’anses intestinales ligaturées, inhibe les
contractions spontanées de l’iléum - 123
4.3.3 Distribution des sites potentiels de liaison de Hc/A dans l’iléum de souris
124
4.3.4 Passage de la muqueuse et liaison de Hc/A aux cellules neuronales
intestinales - 124
4.3.5 Types de neurones ciblés par Hc/A et localisation de SV2C dans le système
nerveux entérique - 125
4.3.5.1 Cellules neuronales ciblées par le Hc/A dans la sous-muqueuse - 125
4.3.5.2 Cellules neuronales ciblées par le Hc/A dans la musculeuse - 125
4.3.5.3 Le récepteur neuronal SV2 de BoNT/A est exprimé par certaines cellules
neuronales et gliales intestinales - 125
4.4 Article n°4 : La neurotoxine botulique A entre par des voies
différentes dans les cellules neuronales et intestinales - 127
4.4.1 Résumé - 127
4.4.2 Cinétique d’entrée de Hc/A dans les cellules neuronales (NG108-15) et
dans les cellules intestinales (Caco-2 et m-ICcl2) - 127
4.4.3 Caractéristiques de la liaison de Hc/A à la membrane cellulaire - 128
4.4.4 Voies d’entrée de Hc/A dans les cellules neuronales et intestinales - 128
4.4.4.1 Une voie d’entrée de Hc/A dans les cellules intestinales est dépendante de
Cdc42 129
4.4.4.2 L’internalisation de Hc/A est dépendante de la dynamine - 129
5 Discussion et perspectives - 131
5.1 Discussion - 131
5.1.1 L’expression synchrone des gènes de la neurotoxine botulique, des
protéines associées et du régulateur BotR est finement régulée lors de la croissance
bactérienne - 131
5.1.2 BoNT/A passe la muqueuse intestinale par un mécanisme de transcytose
qui a lieu préférentiellement au niveau des cryptes intestinales - 134
5.1.3 BoNT/A, injectée dans la lumière intestinale, cible préférentiellement des
terminaisons nerveuses cholinergiques dans la sous-muqueuse et la musculeuse
intestinale - 137
5.1.4 Les voies d’endocytose empruntées par le domaine Hc de BoNT/A
diffèrent en partie dans les cellules neuronales et intestinales - 140
5.2 Perspectives - 142
6 Bibliographie - 145
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