Risque de salmonellose humaine liée à la consommation de fromage à pâte molle au lait cru : développement d’un modèle pour l’appréciation quantitative du risque.

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Fares, Almabrouk (2007) Risque de salmonellose humaine liée à la consommation de fromage à pâte molle au lait cru : développement d’un modèle pour l’appréciation quantitative du risque. Doctorat Epidémiologie, ENVA,UEAR, Unité d’epidémiologie et d’analyse des risques, AgroParistech 2007AGPT0051 p.250.

Plein texte disponible en tant que : - Fares_Thesis_PDF.pdf ( 2129 Kb )

Licence: CC ND 2.0

Résumé

Les salmonelles sont l'une des causes les plus importantes de maladie transmise par les

produits laitiers crus. L'appréciation du risque associé à la consommation de ces produits est

nécessaire et la méthode la plus appropriée pour réaliser ce but est l'utilisation du processus

d'analyse de risque qui associe les microbes pathogènes dans l’aliment au problème de santé

publique. Le but principal de cette thèse est donc d'évaluer quantitativement le risque de

salmonellose humaine lié à la consommation de Camembert fromage au lait cru. Les lacunes

qui sont en général identifiées pour l’appréciation des risques sont le manque de données

quantitatives sur les microbes pathogènes contaminant les aliments. Donc, comme premier

objectif de cette thèse, nous avons developeé une méthode rapide, sensible et fiable pour la

quantification des salmonelles dans le lait artificiellement contaminé. La méthode a combiné

les principes de la méthode du nombre-le plus-probable (NPP) avec une analyse PCR en

temps réel. Avec cette analyse (NPP-PCR en temps réel) fiable niveau de la contamination (1-

5 ufc/mL) du lait peut être énuméré après 8 h d'enrichissement non-sélectif dans l'eau peptone

tamponée. Toutes les valeurs de nombre le plus probable ont bien correspondu au niveau

estimé de contamination des salmonelles inoculées dans des échantillons de lait. Afin

d'évaluer l'utilité de cette analyse de quantification, nous l’avons appliquée aux échantillons

naturellement contaminés de lait de tank d’exploitations laitières situées dans l’Ouest de la

France. Huit (2,68%) des 299 échantillons de lait de tank étaient trouvés positifs, avec des

comptes estimés de nombre plus probable s'étendant de 3,7 à 79,2 /mL de lait. En dépit des

problèmes d'inhibition observés avec quelques échantillons de lait, l'application de l'analyse

par PCR en temps réel pour mesurer des salmonelles dans le lait cru s’est avérée être rapide,

facile à exécuter et extrêmement sensible. Dans l'appréciation des risques potentiels liés aux

salmonelles dans le lait cru et les produits à base de lait cru il était nécessaire d'examiner la

vii

capacité des salmonelles à se développer dans le lait. Par conséquent, nous présentons dans

cette thèse des modèles primaires et secondaires décrivant mathématiquement la croissance

des salmonelles (S. Typhimurium et S. Montevideo) dans le lait à température constante

pendant différentes périodes d'incubation. Le modèle logistique avec délai a été employé pour

décrire la croissance des salmonelles en fonction du temps. Les taux de croissance spécifiques

de S. Typhimurium et de S. Montevideo différent selon le sérotype et la température. Les taux

de croissance maximum ont été alors modélisés en fonction de la température en utilisant le

modèle cardinal secondaire de Rosso. Les valeurs cardinales obtenues avec S. Typhimurium

et S. Montevideo étaient: Tmin 3,02, 3,40 ; Topt 38,44, 38,55 et Tmax 44,51, 46,97°C,

respectivement. À la température optimum de croissance (Topt) les taux de croissance

maximum étaient 1,36 et 1,39 log10 ufc/h-1 pour S. Typhimurium et S. Montevideo

respectivement. Les modèles primaires et secondaires ont permis de bons ajustements aux

données de croissance avec un pseudo R2 = 0.97-0.99. Un modèle d’appréciation du risque de

salmonellose humaine liée à la consommation de Camembert au lait cru est présentée qui est

basée sur les résultats des objectifs précédemment mentionnés dans cette thèse. Différentes

distributions ont été posées en hypothèse pour des paramètres du modèle et une simulation de

Monte Carlo a été employée pour modeler le processus et pour mesurer le risque lié à la

consommation de la portion de 25 g du fromage. Le 99th percentile du nombre de cellules de

salmonelles dans les portions de 25 g de fromage était 5 cellules à l'heure de la

consommation, correspondant à 0,2 cellule des salmonelles par gramme. Le risque de

salmonellose par portion de 25 g est compris entre 0 et 1,2 × 10-7 avec une médiane de 7,4 ×

10-8. Pour 100 millions de portions de 25g, le nombre de cas de salmonellose prévue par le

modèle est en moyenne de 7,4. Quand la prévalence est réduite dans le modèle d’un facteur de

10, le nombre de cas par 100 millions de portions est réduit à moins de 1 cas. En dépit des

limites et des données manquantes, nous avons démontré l'avantage de l’appréciation du

viii

risque non seulement comme outil d’évaluation de risque mais également comme dispositif

d’aide à la prise de décision et à la gestion des risques.

Table des Matières

PUBLICATION RIGHTS - iii

(ABSTRACT) - iv

DEDICATION - ix

ACKNOWLEDGMENTS - x

TABLE OF CONTENTS - xi

LIST OF TABLES - xiv

LIST OF FIGURES - xv

LIST OF ABBREVIATIONS - xvii

Chapter 1: Introduction - 1

Background / Problem Statement - 2

Thesis objectives - 14

Personal objectives - 14

Research objectives - 14

Thesis outline - 15

References - 17

Chapter 2: Literature Review - 22

Salmonella general characteristics - 23

Detection, isolation, and quantification of Salmonella in food - 24

Salmonella surveillance and monitoring programs - 33

French Surveillance systems - 34

Selected international surveillance systems in public health and food safety programs: - 37

Implication of milk and milk products in Salmonella outbreaks - 38

Growth of Salmonella in dairy products - 46

Risk assessment and Salmonella - 51

References - 57

Chapter 3: Combination of Most-Probable-Number Method with LightCycler real-time PCR assay

(MPN-real-time PCR) for Rapid Quantification of Artificially Contaminated Salmonella in Milk Samples

- 76

Abstract - 77

1. Introduction - 79

2. Materials and methods - 81

2.2. Specificity of the real-time PCR assay - 81

2.4. Artificial contamination of milk - 82

2.5. DNA extraction procedures - 83

2.6. SYBR Green real- time PCR assay - 84

3. Results - 85

3.1. Optimization of real-time PCR assay - 85

xii

3.2. Specificity of real-time PCR primers - 85

3.3. Detection limits in pure cultures - 86

3.4. Detection of Salmonella from artificially contaminated milk samples - 86

3.5. Confirmation of real-time PCR products by DNA melting temperature analysis - 87

3.6. Enumeration of Salmonella in artificially contaminated milk samples - 87

4. Discussion - 88

References - 93

Chaptre 4: Application of MPN-real-time PCR Assay for Quantification of Salmonella in Bulk Tank Milk

samples - 107

Abstract - 108

1. Introduction - 110

2. Materials and methods - 112

2.1. Dairy herds - 112

2.2. Detection of Salmonella by LightCycler real-time PCR - 113

2.3. Enumeration of Salmonella by MPN-real-time PCR - 113

2.4. DNA extraction - 114

2.5. LightCycler real-time PCR assay - 114

2.6. Isolation of positive colonies from raw milk samples - 115

3. Results - 116

4. Discussion - 117

References - 121

Chapter 5: Growth of Salmonella in Artificially Contaminated Milk Samples Stored at Different Times

and Temperatures - 126

Abstract - 127

1. Introduction - 129

2. Materials and methods - 130

2.1. Bacterial Strains - 130

2.2. Inoculum preparation - 130

2.3. Sample preparation, and inoculation - 130

2.4. Incubation temperatures, sampling time and bacterial enumeration - 131

2.5. Primary Model - 132

2.6. Secondary Model - 132

2.7. Primary Model Fitting - 133

2.8. Secondary Model Fitting - 133

3. Results and discussion - 134

3.1. Primary modelling curve fitting - 134

3.2. Secondary Model (Cardinal Temperatures) - 136

References - 147

Chapter 6: Quantitative risk assessment of human salmonellosis linked to the consumption of Camembert

cheese made from raw milk - 150

Abstract - 151

1. Introduction - 153

2. Materials and methods - 154

2.1 Hazard identification - 154

2.2. Exposure assessment - 155

2.2.1. Collection of data on raw milk contaminated by Salmonella - 155

2.3. Cheese processing - 158

2.4. Growth model - 159

2.4.1. Growth of Salmonella during cheese ripening to consumption - 160

xiii

2.5. Number of Salmonella in cheese - 162

2.6. Control programs of Salmonella at farms - 162

2.7. Dose-response model - 163

2.7.1. Probability of illness - 164

2.8. Risk characterization - 164

3. Results - 167

3.1. Milk contamination - 167

3.2. Cheese contamination - 168

3.3. Risk of salmonellosis - 170

4. Discussion - 171

References - 175

Chapter 8: General Discussion and Conclusion - 179

Detection and quantification of Salmonella in milk - 180

Predictive modelling of Salmonella growth in milk - 185

Risk assessment model - 187

References - 189

Appendix - 227

Vita - 250

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