Le transcriptome ABC dans la différenciation, la détoxication et la chimiorésistance.

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Garrido, Edith (2007) Le transcriptome ABC dans la différenciation, la détoxication et la chimiorésistance. Doctorat ICSN, ICSN, EP/X p.232.

Autres Localisations: http://www.imprimerie.polytechnique.fr/Theses/Files/Garrido.pdf

Résumé

Les transporteurs ABC constituent une famille de protéines membranaires qui assurent une fonction de transport, au travers des membranes cellulaires. Plusieurs ABC sont impliqués dans des physiopathologies humaines ou induisent des phénotypes de résistance.
Ce manuscrit présente l’étude de l’expression de l’ensemble des ABC, par PCR quantitative, dans différents organes, ou en réponse à un traitement chez l’Homme et la souris.
Nous avons étudié l’effet d’un traitement colchicine sur des lignées cellulaires humaines et des souris. Nous avons montré que ce traitement permettait d’induire l’expression de transporteurs ABC.
Nous avons établi la première cartographie de l’expression des transporteurs ABC au cours du développement hépatique. Certains transporteurs absents du foie fœtal s’expriment après la naissance et jouent probablement un rôle dans la physiopathologie du foie adulte. A l’inverse l’expression de certains transporteurs s’éteint après la naissance, suggérant un rôle dans l’hématopoïèse.
Nous avons mesuré l’expression des transporteurs ABC sur des biopsies de patients atteints de leucémies aiguës en corrélation avec leur sensibilité aux chimiothérapies. De façon intéressante, nous avons montré que des transporteurs jusqu’à présent non décrits dans la résistance pourraient contribuer à un mauvais pronostic.
Enfin, nous avons étudié le transcritpome ABC dans les cellules souches humaines à différents stades de différenciation. Certains transporteurs pour lesquels nous observons des variations d’expression pourraient caractériser un état de différenciation et être impliqués dans l’auto-renouvellement ou la différentiation des cellules souches.

Table des Matières

TABLE DES MATIERES - 7
LISTE DES ABREVIATIONS - 13
CHAPITRE I INTRODUCTION GENERALE - 17
I LA FAMILLE DES TRANSPORTEURS ABC - 17
II ORGANISATION DES TRANSPORTEURS ABC - 19
III TRANSPORTEURS ABC : FONCTIONS ET MALADIES ASSOCIEES - 20
IV CONTEXTE BIOLOGIQUE ET PROBLEMATIQUE - 28
VBIBLIOGRAPHIE - 30
CHAPITRE II LA PCR QUANTITATIVE - 35
I PRINCIPE DE PCR - 35
1 HISTORIQUE - 36
2 UNE APPLICATION : LA PCR QUANTITATIVE - 37
2.1 Le SYBR Green - 39
2.2 La chimie Taqman - 39
II METHODES UTILISEES AU LABORATOIRE - 40
1 PCR SYBR GREEN - 40
1.1 Description de la technique - 40
1.2 Gamme de dilution et efficacité de la réaction - 41
1.3 Dessin des amorces - 43
1.4 Spécificité des amorces - 43
1.5 Inconvénients de la technique SYBR Green-I - 44
2 PUCE A OLIGONUCLEOTIDES - 44
2.1 Elaboration de la puce : critères de choix d’une sonde - 45
2.2 Description de notre puce à oligonucléotides - 45
2.3 Exemple de résultats obtenus sur la puce à oligonucléotides - 46
2.4 Inconvénients de la technique de puce à oligonucléotides - 47
3 PCR QUANTITATIVE TAQMAN - 47
3.1 Sondes TaqMan MGB - 48
3.2 Cartes microfluidiques ou TLDA - 48
3.3 Vérification de chaque courbe d’amplification et détermination du seuil - 48
3.4 Reproductibilité de la PCR utilisant les sondes ABC transporteurs - 49
3.5 Recherche des meilleurs gènes de référence pour la normalisation - 50
3.6 Calcul de la quantification relative - 54
3.7 Calcul de l’efficacité - 54
III BIBLIOGRAPHIE - 60
8
CHAPITRE III EFFET DE LA COLCHICINE SUR L’EXPRESSION DES
TRANSPORTEURS ABC - 65
I INTRODUCTION - 65
1 LA COLCHICINE - 65
2 LA MUCOVISCIDOSE - 65
2.1 Historique - 65
2.2 Epidémiologie, Diagnostic et Symptômes - 66
2.3 Pronostic - 67
2.4 Implication du canal CFTR/ABCC7 - 68
2.5 Stratégies de correction des phénotypes CF - 69
3 INTERET DE LA COLCHICINE POUR LE TRAITEMENT DE LA MUCOVISCIDOSE - 69
II MODELES D’ETUDE - 70
III RESULTATS - 71
1 RESULTATS IN VITRO : TRAITEMENT DE CELLULES HL60 ET K562 PAR LA COLCHICINE - 71
1.1 Traitements effectués - 71
1.2 Choix des meilleurs gènes de référence - 71
1.3 Incidence du traitement sur l’expression des transporteurs ABC - 72
2 RESULTATS IN VIVO : TRAITEMENT DE SOURIS C57BL6 PAR LA COLCHICINE - 75
2.1 Traitements effectués - 75
2.2 Gènes d’intérêt testés - 75
2.3 Choix des meilleurs gènes de référence - 75
2.4 Comparaison de l’expression des transporteurs ABC dans les organes non traités de souris - 77
2.5 Variations d’expression induites par le traitement de souris par la colchicine - 81
2.6 Dans l’intestin - 84
IV DISCUSSION - 86
V BIBLIOGRAPHIE - 91
CHAPITRE IV LES TRANSPORTEURS ABC AU COURS DU DEVELOPPEMENT
HEPATIQUE - 97
I INTRODUCTION - 97
1 LE FOIE FOETAL - 97
1.1 Le développement du foie - 97
1.2 Elimination de xénobiotiques par le foie foetal - 98
2 FONCTIONS DU FOIE ADULTE - 98
2.1 Métabolique - 98
2.2 Production de la bile - 99
2.3 Détoxication - 99
3 IMPORTANCE DES TRANSPORTEURS ABC DANS LE FOIE - 100
II RESULTATS - 101
4 CHOIX DES GENES DE REFERENCE - 102
5 PROFILS D’EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC - 103
III DISCUSSION - 112
III ANNEXE 1 - 116
IV ANNEXE 2 - 122
IV BIBLIOGRAPHIE - 123
9
CHAPITRE V : EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC DANS DES
CELLULES SOUCHES HUMAINES - 129
I INTRODUCTION - 129
1 LES DIFFERENTS TYPES DE CELLULES SOUCHES - 129
2 CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES - 131
2.1 Historique - 131
2.2 Loi Française - 131
2.3 Obtention de cellules souches embryonnaires - 131
2.4 Différenciation de cellules souches embryonnaires - 132
2.5 Des résultats encourageants chez l’animal… - 132
3 LES CELLULES SOUCHES ADULTES - 132
4 LES CELLULES SOUCHES : DE LA RECHERCHE FONDAMENTALE A LA RECHERCHE CLINIQUE - 133
5 LES TRANSPORTEURS ABC DANS LES CELLULES SOUCHES - 133
II RESULTATS - 136
1 CHOIX DES GENES DE REFERENCE - 136
2 PROFILS D’EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC - 138
3 QUANTIFICATION RELATIVE - 142
IV DISCUSSION - 143
V ANNEXE - 147
VII BIBLIOGRAPHIE - 154
CHAPITRE VI : LES TRANSPORTEURS ABC ET LA CHIMIORESISTANCE DANS
LES LEUCEMIES AIGUES MYELOBLASTIQUES - 161
I INTRODUCTION - 161
1 GENERALITES - 161
2 ETIOLOGIE - 161
2.1 Facteurs génétiques - 162
2.2 Facteurs environnementaux - 162
3 SYMPTOMES ET DIAGNOSTIC - 163
3.1 Etats pré-cliniques - 163
3.2 Signes cliniques - 163
3.3 Diagnostic hématologique - 163
3.4 Facteurs de pronostic - 164
4 TRAITEMENTS - 165
5 LEUCEMIES ET ROLE DES TRANSPORTEURS ABC DANS LES MECANISMES DE MULTIRESISTANCE AUX
CHIMIOTHERAPIES - 167
II METHODES - 169
1 PATIENTS LAM TESTES ET DEFINITION DE GROUPES - 169
2 OUTILS, METHODES ET NORMALISATION DES EXPERIENCES DE QPCR - 171
2.1 Transporteurs ABC étudiés - 171
2.2 Choix des gènes de référence - 171
III RESULTATS - 175
1 PROFIL D’EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC DANS LES LAM - 175
2 QUANTIFICATION RELATIVE DE CHAQUE TRANSPORTEUR ABC - 177
IV DISCUSSION - 180
V BIBLIOGRAPHIE - 184
10
CHAPITRE VII : PROFIL D’EXPRESSION DES TRANSPORTEURS ABC DANS
DES LIGNEES CELLULAIRES SENSIBLES ET RESISTANTES - 191
I INTRODUCTION - 191
1 LA CELLULE CANCEREUSE - 191
2 UN TRAITEMENT ANTICANCEREUX : LA CHIMIOTHERAPIE - 193
2.1 Historique de la chimiothérapie anticancéreuse - 193
2.2 La réponse aux chimiothérapies anticancéreuses - 194
2.3 Le phénomène de chimiorésistance - 194
2.4 Un modèle d’étude de chimiorésistance : les lignées cellulaires résistantes - 195
II RESULTATS - 195
1 LIGNEES CELLULAIRES TESTEES - 195
2 CHOIX DES GENES DE REFERENCE - 197
3 CALCUL DU RATIO D’EXPRESSION RQ - 199
4 CYTOMETRIE DE FLUX - 201
5 QUANTIFICATION DU TRANSPORTEUR ABCB4 - 203
6 ESTIMATION DU NOMBRE DE COPIES DE TRANSCRIT PAR CELLULE - 204
6.1 Utilisation d’une gamme étalon - 204
6.2 Calcul du nombre de copies d’ARN par cellules en utilisant l’ARN ribosomal 18S - 212
III DISCUSSION - 212
IV ANNEXE - 217
V BIBLIOGRAPHIE - 219
DISCUSSION GENERALE - 221
MATERIELS ET METHODES - 225
1 MATERIEL BIOLOGIQUE - 225
1.1 Animaux : - 225
1.2 Les lignées cellulaires : - 225
1.3 Les échantillons de foies humains : - 226
1.4 Les échantillons de blastes humains - 226
2 MANIPULATION D’ARN : - 226
2.1 Extraction d’ARN - 227
2.2 Dosage, contrôle de la pureté, de la stabilité et stockage des ARN - 228
3 PUCES A ADN - 228
3.1 Blocage des lames - 228
3.2 Synthèse et marquage des ADNc - 229
3.3 Hybridation - Lavages - 229
3.4 Acquisition d'images en fluorescence - 230
4 PCR QUANTITATIVE - 231
4.1 PCR en SYBR Green - 231
4.2 PCR Taqman - 232
5 ANALYSE PAR CYTOMETRIE DE FLUX - 232

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