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López Kleine, Liliana (2008) Determination du rôle de certaines peptidases bacteriennes par inference a partir de donnees heterogenes et incompletes. Doctorat Biologie et Statistiques Appliquées, UR477, Unité de Biochimie Bactérienne et UR341, Unité de Mathématiques et Informatique Appliquées,, AgroParistech 2008AGPT0056 p.198.
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Résumé
La détermination du rôle des protéines est à l’origine de la plupart des études biologiques. Elle est encore plus d’actualité depuis l’avènement du séquençage des génomes qui fournit des protéines de rôle inconnu en grande quantité. Le séquençage de nouveaux génomes a permis, par ailleurs, l’obtention de données post-génomiques à haut débit comme les données transciptomique. Il a permis également la construction de données comme les profils phylogénétiques. L’approche que nous avons utilisée, mêlant statistiques et biologie, intègre ces données post-génomiques pour prédire puis valider le rôle de protéines protéolytiques chez Lactococcus lactis.
Nous avons procédé en trois étapes réalisant, dans un premier temps, une inférence statistique des liens prédits entre protéines du lactocoque basée sur cinq sources de données distinctes : le graphe des voies métaboliques, des données transcriptomiques, des profils phylogénétiques, des distances entre gènes en paires de bases et des données protéomiques issues de gels 2D. Ces liens nous ont permis de émettre des hypothèses biologiques sur le rôle de protéines cibles. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé des expériences de laboratoire pour valider les prédictions comparant la souche sauvage aux mutants de délétion de PepF et YvjB. La troisième étape de ce travail a consisté à réaliser une analyse de sensibilité dans le but de souligner les données qui ont contribuées le plus aux prédictions et de trouver un sous-ensemble de données aboutissant aux mêmes prédictions.
Appliquée à deux enzymes protéolytiques potentielles du lactocoque, PepF et YvjB, cette approche nous a permis de vérifier leur participation dans l’export de protéines telle qu’elle avait été prédite par l’analyse statistique. Nous avons montré que PepF participe à l’export de protéines libérées dans le milieu extérieur (protéines sécrétées) en hydrolysant le peptide signal libéré par la signal peptidase I. PepF participe par ailleurs aussi à la synthèse de la paroi cellulaire et au métabolisme du pyruvate, fonctions aussi prédites par l’analyse statistique. YvjB participe à la mise en place et la maturation d’un autre groupe de protéines exportées, les lipoprotéines. Elle est nécessaire pour la localisation correcte de certaines lipoprotéines et participe au clivage de leur peptide signal.
Notre approche s’est avérée très utile dans la mesure où elle permet d’émettre des hypothèses biologiques qui guident les validations expérimentales. Par ailleurs, cette démarche est applicable à tout organisme entièrement séquencé pour lequel suffisamment de données post-génomiques sont disponibles.
| Type d'EPrint: | Thèse (Doctorat) |
|---|---|
| Directeur de Thèse: | Monnet, Véronique |
| Date: | 07 Octobre 2008 |
| Jury de Thèse: | Pugsley, Anthony et Canu, Stéphane et Gaillardin, Claude et Daudin, Jean-Jacques et Trubuil, Alain |
| Ecole Doctorale: | ED 435 AGRICULTURE, ALIMENTATION, BIOLOGIE, ENVIRONNEMENTS ET SANTE |
| Discipline: | Biologie et Statistiques Appliquées |
| Fonds: | AgroParistech |
| Institution: | AgroParistech |
| Laboratoire: | UR477, Unité de Biochimie Bactérienne et UR341, Unité de Mathématiques et Informatique Appliquées, |
| Sujets: | 7. Sciences de la vie et ingénierie du vivant |
| Mots-clés libres: | Peptidases, Peptidases, Proteolysis, Protéolyse, Proteins role, Rôle des protéines, Statistical decision, Infèrence statistique |
| Code ID: | 4768 |
| Déposé par : | Marina Briffaut |
| Déposé le : | 13 Février 2009 |
Table des Matières
1. Introduction 1
2. Revue bibliographique 3
2.1 La protéolyse bactérienne 3
2.1.1 Classification des protéases et peptidases 3
2.1.2 Fonctions de la protéolyse chez les bactéries 6
2.1.2.1 La nutrition azotée 6
2.1.2.2 La dégradation des protéines mal repliées 8
2.1.2.3 La virulence 9
2.1.2.4 Le recyclage ou turnover des protéines 10
2.1.2.5 Protéolyse intermembranaire et régulatrice 10
2.1.2.6 Peptidases participant à la maturation et l’export des protéines 11
2.2 Les peptidases et protéases du lactocoque 11
2.2.1 Les peptidases et protéases participant principalement
à la nutrition azotée 13
2.2.2 Les peptidases dédiées aux fonctions autres que la
nutrition azotée 14
2.2.3 Les peptidases et protéases de Lactococcus lactis
de rôle inconnu ou mal connu 15
2.2.4 Les peptidases d’intérêt 16
2.2.4.1 PepF ou l’oligoendopeptidase F 16
2.2.4.2 YvjB ou Eep (enhanced expression of pheromone) 19
2.2.4.3 Yaih ou la prényl-peptidase CAAX 23
2.3 Prédiction du rôle des protéines 25
2.3.1 Approches existantes 25
2.3.1.1 Méthodes non supervisées et sans intégration de données 27
2.3.1.2 Méthodes supervisées et permettant l’intégration de données 32
2.3.1.3 Méthodes à noyaux 36
2.3.1.4 La KCCA : une méthode à noyaux supervisée qui permet
l’intégration de données 45
2.3.2 Analyse de sensibilité 48
2.3.2.1 Plan d’expériences 49
2.3.2.2 Analyse de variance sur la sortie 51
2.4 Thèmes concernant les rôles prédits pour les peptidases d’intérêt 52
2.4.1 Les protéines exportées 52
2.4.1.1 La synthèse des protéines exportées 53
2.4.1.2 La reconnaissance des protéines exportées 54
2.4.1.3 La translocation des protéines 56
2.4.1.4 Le peptide signal et son clivage 57
2.4.1.5 Hydrolyse du peptide signal 58
2.4.1.6 Les lipoprotéines 59
2.4.1.7 Les protéines ancrées 60
2.4.2 Structure du peptidoglycane 61
2.4.3 Métabolisme du pyruvate 63
Détermination du rôle de peptidases bactériennes/ Table de matières
LOPEZ KLEINE Liliana / 2008 / AgroParisTech
ii
3. Résultats de la KCCA 65
3.1 Reconstruction des liens connus des voies métaboliques 65
3.2 Reconstruction des liens connus : régulons et interactions
physiques entre protéines 65
3.3 Liens prédits et hypothèses sur le rôle des protéines cibles 67
4. Résultats des tests expérimentaux des liens prédits pour PepF 70
4.1 Article I: Role of bacterial peptidase F inferred by statistical analysis
and further experimental validation 70
4.2 L’export de protéines est affecté dans un mutant pepF, en conditions
de surproduction de protéines exportées 84
4.2.1 Analyse d’une lipoprotéine lors de la surproduction d’une protéine
sécrétée (NucB) 84
4.2.2 Analyse des protéines sécrétées (Usp45) lors de la surproduction
d’un substrat de la sortase 84
5. Résultats des tests expérimentaux des liens prédits pour YvjB (Eep) 87
5.1 Article II : YvjB, an Eep-like protein, is an essential partner of the signal peptidase II in the
maturation of certain lipoproteins in Lactococcus lactis 87
6. Résultats de l’analyse de sensibilité 108
6.1 Article III: Finding important data subsets for kernel-based
bacterial protein role predictions by performing a sensitivity analysis 110
6.1.1 Données supplémentaires de l’article III 116
6.2 Résultats de l’analyse de sensibilité sur YvjB 117
7. Matériels et Méthodes 119
7.1 Constructions génétiques 120
7.2 Protocoles de biologie moléculaire 122
7.3 Protocoles de microbiologie 126
7.4 Protocoles de biochimie et protéomique 127
7.5 Logiciels et obtention des données 130
Détermination du rôle de peptidases bactériennes/ Table de matières
LOPEZ KLEINE Liliana / 2008 / AgroParisTech
iii
7.6 Analyses statistiques 134
8. Discussion 136
9. Conclusions 142
10. Perspectives 142
11. Références 144
12. Présentations de ce travail 159
13. Annexes 161
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