Analyse d’une protéine ciblée par immunoaffinité et digestion sur micro-réacteur enzymatique couplés en ligne à une analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse : synthèse, caractérisation et miniaturisation des outils bioanalytiques.

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Cingöz, Annabelle (2009) Analyse d’une protéine ciblée par immunoaffinité et digestion sur micro-réacteur enzymatique couplés en ligne à une analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse : synthèse, caractérisation et miniaturisation des outils bioanalytiques. Doctorat Chimie Analytique, Laboratoire Environnement et Chimie Analytique - ESPCI, Paris VI p.294.

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Résumé

L’étude de protéines ciblées comme des biomarqueurs dans des matrices biologiques est un réel défi pour le diagnostic médical. De nos jours, la technique de choix est la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse. Cependant, l’analyse d’une protéine induit une étape de traitement d’échantillon afin de purifier au mieux la matrice biologique. En vue d’une automatisation totale de l'analyse, une étape d’extraction sélective a été couplée à un réacteur enzymatique suivie de l’analyse par CPL-SM. Tout d’abord, différents réacteurs enzymatiques ont été préparés et évalués. Puis, une étape extraction a été développée via un immunoadsorbant (IS). L’IS a ensuite été couplé à l’analyse pour une application à un échantillon de plasma dopé.

Enfin, un des défis analytiques actuels est la miniaturisation du système analytique afin d’augmenter la sensibilité. Ainsi, un réacteur enzymatique a été préparé dans en format capillaire. L’efficacité de digestion a été démontrée sur un substrat de faible poids moléculaire. La synthèse d’un IS miniaturisé sera envisagée dans le but d’un couplage avec le réacteur enzymatique et l’analyse par nano-CPL/SM.

Table des Matières

Table des matières

Résumé

Liste des publications et des communications orales et écrites

Introduction



Chapitre I : Analyse des protéines



I.1. Structure et propriétés des protéines

I.2. Méthodes analytiques pour l’identification de protéines

I.3. Traitement de l’échantillon

I.4. Conclusion

I.5. Références



Chapitre II : Utilisation d’outils bioanalytiques pour l’analyse d’une protéine ciblée



II.1. Extraction sélective d’une protéine ciblée

II.2. Digestion sur réacteur enzymatique

II.3. Analyse totale en ligne d’une protéine ciblée

II.4. Conclusion

II.5. Références



Chapitre III : Développement d’une méthode de digestion en ligne



III.1. Une protéine modèle, le cytochrome c

III.2. Mise au point de l’analyse par LC-MS/MS

III.3. Développement d’un microréacteur de trypsine

III.4. Synthèse et caractérisation du réacteur de pepsine

III.5. Conclusion

III.6. Références



Chapitre IV : Analyse en ligne d’une protéine ciblée dans du plasma



IV.1. Stratégie analytique

IV.2. Immunoextraction du cytochrome c

IV.3. Analyse en ligne d’une protéine par immunoextraction

IV.4. Conclusion

IV.5. Références



Chapitre V : Miniaturisation de l’analyse en ligne d’une protéine ciblée



V.1. Miniaturisation du système chromatographique

V.2. Miniaturisation de l’IMER

V.3. Analyse d’un digestat de cytochrome c par HPLC-Chip/MS

V.4. Conclusion

V.5. Références



Conclusion et perspectives



Annexes

Liste des tableaux

Liste des figures

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