Génération de gouttes en microfluidique pour l’étude de la cellule unique, l’extraction liquide-liquide et la vectorisation.

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Mary, Pascaline (2009) Génération de gouttes en microfluidique pour l’étude de la cellule unique, l’extraction liquide-liquide et la vectorisation. Doctorat Physique des Liquides et Matière Molle, MMN, ESPCI.

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Résumé

La génération contrôlée et à haut débit de gouttes de volume caractéristique un nanolitre dans des canaux microfluidiques permet le suivi simultané de réactions dans

des centaines de microréacteurs. En particulier, l’encapsulation d’une cellule par goutte ouvre la voie de l’étude de populations hétérogènes d’organismes biologiques au niveau de la cellule unique.

Cette thèse décrit, dans une première partie, le développement d’un microsystème dédié à la mesure haut débit de l’expression de gênes d’intérêt de cellules individuelles isolées dans des gouttes, par la méthode de transcription inverse suivie d’une réaction de

polymérisation en chaîne en temps réel.

Dans une deuxième partie, la technologie de gouttes est mise à profit pour une étude fondamentale originale des transferts de masse entre une phase dispersée et une phase

porteuse. Nous illustrons ce chapitre par deux applications de l’extraction liquide-liquide dans des microgouttes : la première concerne l’extraction du zinc sous forme ionique, la deuxième présente les premières étapes de la purification de l’ARN.

Enfin, la dernière partie constitue une ouverture sur les applications potentielles de la génération d’émulsions micrométriques complexes pour la vectorisation de médicaments ou de vaccins par phagocytose.

Table des Matières

Introduction 1

1 Microfluidique en gouttes pour la biologie cellulaire 3

1.1 La cellule - 3

1.1.1 Rappels sur la cellule - 3

1.1.2 De la nécessité d’étudier la cellule à l’échelle individuelle - 4

1.1.3 Approches expérimentales conventionnelles de l’étude d’une cellule

unique - 5

1.2 La microfluidique, un outil adapté à l’étude de la cellule - 6

1.2.1 La microfluidique ou l’art de manipuler des petits volumes de liquide 6

1.2.2 Analyse de l’expression des gènes d’une cellule en microfluidique . . 7

1.3 La microfluidique discrète dans des gouttes - 12

1.3.1 Génération de gouttes dans des microsystèmes - 13

1.3.2 Manipulation de gouttes - 15

1.3.3 Stabilisation des gouttes pour une observation à long terme - 16

2 Analyse quantitative haut débit de l’expression de gènes sur la cellule 19

2.1 Stratégie expérimentale développée lors de cette thèse - 19

2.1.1 Conception des microsystèmes : matériaux employés - 19

2.1.2 Connectiques, stockage, génération et stabilisation des gouttes . . . 21

2.1.3 Montage expérimental - 25

2.2 Analyse quantitative de l’expression de gènes sur ARN et cellule en microfluidique

- 36

2.2.1 Analyse d’un échantillon d’ARN - 36

2.2.2 RT-PCR quantitative sur cellule unique - 40

3 Extraction liquide-liquide dans les microgouttes : fondements et applications

51

3.1 Article : Microfluidic droplet-based liquid liquid extraction - 51

3.2 Extraction réactive du zinc suivi par fluorescence dans des gouttes - 65

3.3 Premières étapes de purification de l’ARN dans des gouttes - 69

3.3.1 Transfert de l’ADN à l’interphase - 71

3.3.2 Précipitation des protéines - 72

4 Génération contrôlée d’émulsions micrométriques pour la phagocytose 73

4.1 Introduction - 73

4.2 Article : Monodisperse colloids generated with nanofluidic technology - 74

4.3 Vers des émulsions submicrométriques - 97

Conclusion 99

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